Sus salas y reservas visitables exhiben cientos de piezas, desde minerales y rocas hasta diversos ejemplares de hongos, plantas y animales. Las unidades culturales de Botánica, Zoología de Invertebrados y Zoología de Vertebrados poseen depósitos con colecciones para estudios científicos. Mientras que la Biblioteca y Centro de Documentación Joaquín Frengüelli guarda un importante acervo de publicaciones periódicas y libros.
Este valioso museo del Estado santafesino nació durante la Gobernación de Manuel Menchaca, el 15 de mayo de 1914; inicialmente, se llamó Museo Escolar Florentino Ameghino, su creación había sido impulsada por el Consejo General de Educación y su propósito era proveer a docentes elementos didácticos de ciencias naturales y sociales; por entonces ya poseía equipos de proyección, entre ellos un epidiascopio y un cinematógrafo.
Funcionó primero en el salón de actos de la Escuela Sarmiento y durante sus diez primeros años lo dirigieron Juan Ravinale, Jorge Laferriére, Ramón Dufour y Ernestina Molina. Se destacó el paso prolongado de Ariosto Licursi, un estudiante del Colegio Nacional de Santa Fe, también periodista y médico, quien habría de perfeccionar el servicio educativo del museo y proyectar su expansión. Hacia 1924, con el arribo del naturalista Roberto Rovere a su dirección, el museo se mudó a un local más amplio, donde pudo dividirse en salas temáticas. En esos años se incorporó valor científico a la colección, se estimó el estudio de los objetos y su catalogado sistemático, se iniciaron campañas propias y un diálogo con otras instituciones. En síntesis, se posicionó al Ameghino como uno de los museos importantes a nivel nacional.
Volvió a mudarse la institución, esta vez a una vieja casona, hoy demolida, sobre calle Moreno. Allí se desarrolló buena parte de su historia, bajo la dirección de Paulina F. de Bellocchio y Minerva Pandolfo de Rafaghelli, quienes profundizaron el valor de las colecciones, afianzaron el prestigio ganado y fortalecieron el área pedagógica. En este sentido, se gestionó un catálogo de colecciones para consulta docente y se desarrolló una planta de cadetes propios. El objetivo de esta innovadora idea fue acercar a las escuelas de la ciudad ejemplares taxidermizados, mapas, bibliografía y cualquier material que se pudiera aportar a modo de asistencia escolar.
En 1943 asumió como director el naturalista Guillermo Martínez Achenbach e imprimió un nuevo rumbo: en 1949 gestó una división institucional, por un lado el Museo Didáctico Rosario Vera Peñaloza y por otro el Museo Provincial de Ciencias Naturales Florentino Ameghino.
En el período posterior a la división del museo escolar se destaca el incremento de las colecciones producto de campañas propias y la edición de publicaciones institucionales como Anales y Comunicaciones. Ambas tuvieron por objeto divulgar estudios propios, tendencia que se mantuvo aún en la dirección posterior de Carlos Virasoro (entre 1978 y 2014), quien siguió el lineamiento de su antecesor: recolectar, determinar y coleccionar elementos de ciencias naturales, dictar conferencias y organizar cursos específicos.