Su acervo se conforma por una variada colección de objetos: textiles (vestimenta de fiesta y de calle, accesorios), enseres, máquinas y electrodomésticos (radios, máquinas de escribir, cámaras fotográficas). Y hasta mobiliario y elementos de comercios típicos como peluquerías y farmacias; o piezas de ornamentación de construcciones significativas santafesinas, como el Puente Colgante. Completa su acervo un fondo documental y fotográfico conformado por donaciones de particulares u obtenidas por «campañas de rescate» pro-movidas desde la institución.
El Museo de la Ciudad desarrolla además programas de investigación patrimonial, muestras temporarias e itinerantes. Su misión es promover la socialización del patrimonio urbano santafesino desde fines del siglo XIX hasta la segunda mitad del siglo XX.